SEM掃描電鏡生物樣品制備要求和生物樣品制備方法介紹

生物樣品具有含水量高、質地柔軟、導電性差、容易變形等特點，因此采用掃描電鏡觀察生物樣品時，要對樣品進行必要的處理。

SEM掃描電鏡生物樣品制備要求

①樣品要盡可能干燥，若樣品中含有水份，水分揮發會造成倉內真空度急劇下降，導致圖像漂移，有白色條紋，甚至會影響燈絲壽命;

②熱穩定性好，熱穩定性差的樣品往往在電子束的轟擊下分解，釋放氣體和其他物質，污染掃描電鏡;

③導電性好，導電性差的樣品會發生荷電效應，造成圖像畸變，亮點亮線，像散等;

④不含強磁性，強磁性的樣品觀察一般會出現嚴重的像散，無法消去，磁性粉末如果粘的不牢固還可能會吸附到探頭上，損害sem掃描電鏡。

掃描電鏡生物樣品通常指的是動物的體液、肌肉、毛發和一些組織器官，植物的根、莖、葉、果實等，以及各類微生物(細菌、真菌等)。生物樣品的含水量高，一般為70%-80%，只有少數的樣品，如一些花粉、毛發等可以直接放入sem掃描電鏡中觀察，大部分生物樣品需要經過脫水干燥處理后才能進行觀察。

掃描電鏡生物樣品制備的關鍵步驟是干燥，應盡量減少因水分蒸發導致的形變。大多數動植物，特別是柔軟的細胞和組織，在干燥時由于體積應力和表面張力的作用，容易發生明顯的塌陷和變形，造成形貌失真。

SEM掃描電鏡生物樣品制備方法

取材：

一般使用鋒利的刀片將樣品切成5mm見方，高度3mm左右，在滿足觀察條件的前提下，樣品小一些更好，一方面臨界點干燥儀的樣品倉較小，另一方面，小的樣品尺寸固定液更容易滲透到樣品內部，固定效果更好。取材完成后，先進行清洗(超聲清洗3-5min)，再迅速地放置到固定液中，放置樣品脫水皺縮。

固定：

臨界點干燥法前處理常用的固定劑有戊二醛和四氧化鋨。

戊二醛是一種五碳醛，一般配制濃度為1-4%，常用濃度為2.5%(PH7.2-7.4)。一般市場上所售賣的戊二醛濃度為25%，使用前需要對其稀釋。溫度較高或者堿性條件下，戊二醛容易發生聚合失去醛基，降低交聯能力，因此，一般使用0.1M的磷酸緩沖液作為溶劑稀釋戊二醛，并在4℃下保存。

特別注意，戊二醛對皮膚有硬化作用，皮膚粘上會變黃，難以洗掉，所以使用時一定要帶手套。

它的反應速度快，是優良的前固定劑。用戊二醛前固定的樣品不易變脆，可以進行長時間固定(但Z好不要超過一個星期)，因而適用于遠離實驗室或野外現場取材。但戊二醛對于含脂類較多的樣品固定效果不佳，如細胞膜。

四氧化鋨是一種很強的氧化劑，一般配制濃度為0.5-2.0%，常用濃度為0.5-1.0%(PH7.2-7.4)。它具有很強的毒性，四氧 化鋨氣體對呼吸系統有刺激，對眼睛有嚴重的破壞作用，因此在使用時應特別小心，盡可能在通風櫥中進行，并且嚴格控制用量。但它作為固定劑擁有一些獨特的優點：

①四氧化鋨可以與脂類、糖類和蛋白質反應。其對脂類的固定作用可以補充醛類固定劑對脂類固定不足的缺點。

②用四氧化鋨固定材料時，被還原的鋨能沉積在樣品表面上，能增加膜的反差，起到“電子染色”作用，往往細胞膜結構比較清晰。

因此，含脂類物質比較少的生物樣品(如植物類)，采用戊二醛固定，將采取的樣品泡入2.5%的戊二醛溶液中浸泡超過4h即可。對于含脂類物質較多的樣品(如細胞膜)，采用戊二醛和四氧 化鋨雙重固定，先在2.5%的戊二醛溶液中浸泡3h以上，再浸泡在1%的四氧化鋨1h。

漂洗：

用0.1M的磷酸緩沖液沖洗4次，每次20min，洗凈固定液。

脫水：

配置濃度分別為30%，50%，70%，90%，1**%的酒精，用不同濃度的酒精溶液逐級脫水，從低濃度到高濃度(30%2次，50%2次，70%1次，90%1次，BAI分百兩次)浸泡1-2次，每次10min。

置換：

將脫水后的樣品浸泡在醋酸異戊酯溶液中15min左右，醋酸異戊酯的JI性較低，臨界點干燥時，能夠更好地與二氧化碳置換，干燥效果更好。

干燥：

采用二氧化碳臨界點干燥儀進行干燥。此方法是根據物質處在臨界點時的特殊物理狀態設計的一種干燥方法。在臨界狀態下，液體和氣體的密度相等，氣液界面完全消失，液體的表面張力系數為零。簡單來說就是，通過消除樣品表面張力、使得掃描電鏡樣品在不受表面張力損傷的條件下干燥。

經過以上步驟，就能得到飽滿的不皺縮的sem掃描電鏡生物樣品了。