光片熒光顯微鏡（Light Sheet Fluorescence Microscopy, LSFM）的概念產(chǎn)生于1903年，但此后很長(zhǎng)時(shí)間并無太多發(fā)展。上世紀(jì)九十年代，華盛頓大學(xué)的Francis Spelman實(shí)驗(yàn)室為了對(duì)小鼠毛細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和耳蝸的其他特性進(jìn)行定量測(cè)量，發(fā)展了一系列實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)室研究人員受到前人使用側(cè)向光片照明觀察表面結(jié)構(gòu)的啟發(fā)，發(fā)明了正交平面熒光光學(xué)切片裝置（orthogonal plane fluorescence optical sectioning, OPFOS），并**次獲得了整個(gè)耳蝸的清晰熒光圖像(1) (2) (3)。2004年，SPIM（Single plane illumination microscopy ）文章的發(fā)表大大促進(jìn)了光片顯微鏡的發(fā)展和使用(4)，文章強(qiáng)調(diào)了其用于胚胎發(fā)育研究的實(shí)用性，并給出了青鳉神經(jīng)節(jié)細(xì)胞搏動(dòng)以及果蠅胚胎發(fā)育長(zhǎng)時(shí)間成像的熒光圖像。 2010年，在**屆光片熒光顯微鏡研討會(huì)上，研究者們決定將LSFM作為這一類顯微鏡的統(tǒng)一名稱(5)。后續(xù)又出現(xiàn)了很多形式的光片顯微鏡，如掃描光片(6)、雙光子掃描光片(7)和bessel beam(8)、lattice(9)等新式光片顯微鏡。這些方法不斷改善光片顯微鏡的成像分辨率、穿透深度和成像視野，以期滿足生物學(xué)發(fā)展的需要。

光片顯微系統(tǒng)成像原理

光片顯微系統(tǒng)使用一層光束從樣品側(cè)面激發(fā)熒光樣品，使用CCD或SCMOS進(jìn)行檢測(cè)，照明光路和熒光檢測(cè)光路互相垂直。由于樣品受激發(fā)的平面就是成像平面，不存在離焦激發(fā)，可以自動(dòng)獲得光學(xué)切片，從而將光漂白和光學(xué)損傷降到*低。光片顯微系統(tǒng)使用CCD或SCMOS成像，速度通常為每秒幾十幀，甚至上百幀，所以通過在光片下移動(dòng)樣品使入射光束激發(fā)不同的平面，可以很容易又非常快速的得到整個(gè)組織的3D圖傳統(tǒng)共聚焦的激發(fā)和檢測(cè)是同一個(gè)方向，整個(gè)照射區(qū)域都處于被激發(fā)狀態(tài)，沒有被檢測(cè)的區(qū)域經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的照射易被淬滅，無法保證幾天的記錄；另外共聚焦使用點(diǎn)掃描成像，速度相對(duì)較慢。

光片熒光顯微鏡與共聚焦顯微鏡的區(qū)別

2015年，Leica推出了自己的光片系統(tǒng)，該系統(tǒng)使用獨(dú)特的 TwinFlect 反光鏡裝置使激發(fā)光束從左右兩個(gè)方向入射到樣品上，照明均勻，保證了細(xì)胞水平的分辨率。成像速度快、分辨率高和光毒性低的特點(diǎn)可使樣品在該系統(tǒng)中保持其生物活性，完成數(shù)小時(shí)乃至數(shù)天的長(zhǎng)時(shí)間活體生物培養(yǎng)及成像。另外，Leica光片系統(tǒng)以共聚焦為基礎(chǔ)，可以實(shí)現(xiàn)與共聚焦顯微鏡的聯(lián)合使用，完成光激活、光轉(zhuǎn)換等操作及后續(xù)追蹤的實(shí)驗(yàn)。

Leica光片顯微系統(tǒng)常見應(yīng)用

• 胚胎與小型生物(如模式動(dòng)物斑馬魚、線蟲、果蠅等，植物擬南芥等)發(fā)育過程中的快速三維成像，例如：細(xì)胞遷移、心臟及血管發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育等。

• 三維細(xì)胞培養(yǎng)、球體和囊腫、組織培養(yǎng)、器官培養(yǎng)的實(shí)時(shí)成像。

• 結(jié)合共聚焦或雙光子激光顯微鏡，完成光學(xué)刺激與追蹤的功能，觀察和實(shí)驗(yàn)方式更為靈活多樣。

1. 快速3D成像

斑馬魚血管系統(tǒng)3D重構(gòu)

2. 活體快速長(zhǎng)時(shí)間3D成像，捕捉整個(gè)動(dòng)態(tài)過程

高速成像：斑馬魚跳動(dòng)的心臟

果蠅背部閉合過程

3. **可以結(jié)合共聚焦和光片的系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)光學(xué)操作的后續(xù)追蹤

斑馬魚神經(jīng)元光轉(zhuǎn)換(Kaede)后，持續(xù)記錄該細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)

斑馬魚尾部，光轉(zhuǎn)換(Kaede，405 nm)后細(xì)胞去修復(fù)被多光子激光造成的損傷部位

使用LAS X 3D分析追蹤光轉(zhuǎn)換的細(xì)胞

長(zhǎng)時(shí)間的圖像采集需要維持樣品的活性，Leica光片系統(tǒng)可加載孵育裝置，為樣品提供良好的生長(zhǎng)條件，保持活性。另外整個(gè)系統(tǒng)的開放性很高，有更多可操作的空間。

參考文獻(xiàn)

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