使用SEM掃描電鏡觀察細(xì)胞樣品的制備方法

一、原理

超薄切片實(shí)際上是樣品的二維切片，不能表達(dá)細(xì)胞的三維結(jié)構(gòu)，而且在觀察切片后所拍攝的顯微照片時(shí)，容易造成錯(cuò)誤的印象，用掃描電子顯微鏡能直接觀察標(biāo)本表面的三維空間結(jié)構(gòu)，真實(shí)地反映各種細(xì)胞表面和斷裂面的形態(tài)特征，其照明源與透射電鏡基本相同，由電子槍經(jīng)聚光鏡匯聚成極細(xì)胞的電子探針，電子探針受掃描發(fā)生器控制，在樣品表面逐點(diǎn)逐線的掃描，樣品被電子轟擊所產(chǎn)生的二次電子被收集、轉(zhuǎn)換、放大，在電視熒光屏上同步掃描成像。

二次電子的發(fā)射量與樣品的表面形態(tài)有關(guān)，從而在熒光屏上出現(xiàn)表面起伏的樣品立體圖像。掃描電鏡細(xì)胞樣品的預(yù)處理包括取材、固定、脫水等。

二、操作基本步驟

1 、取材

SEM掃描電鏡下觀察的樣品尺寸要求比較寬松，一般1cm3左右樣品都能適合大多數(shù)掃描電鏡觀察。

2 、固定

鋪片培養(yǎng)的細(xì)胞取出浸入 PBS 中，漂洗細(xì)胞表面。然后將細(xì)胞鋪片放入青霉素小瓶中，加 4 ℃ 預(yù)冷的 3% 戊二醛，在 4 ℃ 固定 2h 或過(guò)夜，吸出固定劑，用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min ，再用 4 ℃ 預(yù)冷的 1% 鋨酸。在 4 ℃ 固定 1h ，然后用 PBS 浸洗 2 次，每次 10min 。

3 、脫水

丙酮 / 醋酸異戊酯( 1 ： 1 )脫水 10min ，接下來(lái)醋酸異戊酯脫水 30min ，或用系列梯度酒精( 30% 、 50% 、 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 **** )脫水，每種濃度酒精通過(guò) 2 次，每次 15min 。

4 、干燥

以臨界干燥法*理想，但要有專門的儀器臨界點(diǎn)干燥器。當(dāng)實(shí)驗(yàn)室不具備此種儀器時(shí)，可采用冰凍干燥法和乙腈干燥法。乙腈干燥法的關(guān)鍵是乙腈置換。樣品經(jīng)上述處理后，浸入 520% 的乙腈溶液中，然后依次更換 70% 、 80% 、 90% 、 95% 、 **** 的乙腈溶液，每次浸泡 15-20min ，*后再換 **** 乙腈。然后進(jìn)行真空干燥。即將乙腈置換后的樣品連同青霉素瓶一起放到真空鍍膜臺(tái)的真空裝置內(nèi)，抽低真空，一般需 30-50min 。樣品干燥后，待其溫度升至室溫時(shí)再放氣，取出樣品。

5 、樣品導(dǎo)電處理

用真空噴鍍法。所用的儀器為真空噴鍍儀，樣品被安置在離蒸發(fā)源約 10-15cm 處的樣品臺(tái)上，樣品進(jìn)行旋轉(zhuǎn)活動(dòng)，先噴碳。后噴金，噴鍍應(yīng)均勻，完成后鏡下觀察。